脂肪酶生产中生物技术的作用

来源：职称阁分类：医学论文时间：2019-01-22 11:23热度：

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脂肪酶生产中生物技术的作用

　　关键词：脂肪酶;生产;生物技术

　　脂肪酶，又称三酰甘油酰基水解酶，是一类能催化天然油脂水解生成甘油二脂、甘油单酯、甘油和游离脂肪酸的酶，也是一类能催化酯类化合物合成、酯交换等反应的酶，普遍存在于动植物、微生物中，是一种重要的生物催化剂。关于脂肪酶最早的报道，要追溯到1834年兔胰脂肪酶活性的研究。这些年来，研究者对脂肪酶进入了深入研究。目前，脂肪酶及酶制剂已被广泛应用于食品加工、制药、污水处理等行业。动植物原料提取法、化学合成法和微生物发酵法是脂肪酶的制备方法。提取法是以富含脂肪酶的动植物组织为原料进行提取，该法分离提纯工艺复杂、产量低。化学合成法是在分析酶的氨基酸组成顺序的基础上再化学合成，此法成本高。生物发酵法是指通过人工控制微生物生长繁殖而获得酶，受环境影响小、资源充足、生产脂肪酶的酶周期短，效率高、生产成本低，此外，微生物脂肪酶的作用酸碱度区间、温度范围以及底物专一性比动植物脂肪酶的优势更明显，故该种酶的应用前景也最为光明。当下市售商品化脂肪酶主要源于各种微生物的发酵培养。近年来，国外学者在产脂肪酶菌种的筛选与分离、发酵条件的控制等方面做了大量研究，为微生物脂肪酶的工业生产奠定了基础。

　　1脂肪酶生产菌的筛选与分离

　　脂肪酶在微生物中普遍存在，有65个属的微生物生产脂肪酶，包括28个属的细菌、4个属的放线菌、10个属的酵母菌、23个属的其他真菌。微生物脂肪酶的生产主要有固、液两种发酵法。固态发酵(SSF)主要采用来源于工业三废、植物油加工厂、牛奶加工厂等的霉菌(酒曲菌属、曲霉、青霉菌、地丝菌数、毛霉菌属、根毛霉属等)生产。Santis-Navarro等利用植物油废弃物进行固态发酵生产脂肪酶，发现在4.5L反应罐中高温(温度高于45℃)固体发酵发酵20天，能获得活力120000UA/g的脂肪酶[1]。液态发酵(SME)法主要利用的是细菌、酵母菌及少部分霉菌。其中细菌主要是杆菌属：枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、噬碱芽孢杆菌、产碱杆菌属、节细菌属、芽孢杆菌、假单胞菌伯克氏、色素细菌;酵母菌：皱褶假丝酵母、胶红假丝酵母、热带假丝酵母、柱状假丝酵母、畸形假丝酵母、南极假丝酵母、木糖毕赤酵母及星状毛孢子菌等。ThiagoA.Marques[2]等利用一种新型康氏木霉液态发酵法生产脂肪酶，脂肪酶的活性最高能达108.7U/mL。MarimuthuKrishnaveni从土壤样品中筛选出了可以产生脂肪酶的金黄色葡萄球菌MTCC10787，该法经济高效[3]。

　　2脂肪酶生产条件研究

　　发酵法生产脂肪酶，除了筛选出高效产脂肪酶的菌株，其生产条件也很重要。生产条件主要包括培养温度、pH、溶氧及培养基组分。其中培养基类别往往决定了组分种类、含量。培养基一般分人工合成、天然和混合培养基。人工合成培养基成分明确，天然培养基一般为工业、农业残余物。混合培养基是前两者混合。WaelAbdelmoez用油脂化工废弃物做培养基，通过皱褶假丝酵母ATCC14830液态深层发酵制得脂肪酶，活性最高能达10U/mL[4]。为考察温度、pH、溶氧及培养基等因素对脂肪酶生产的综合影响，研究者一般经单因素、正交试验及响应面等统计实验设计法，以提高脂肪酶产量。Chien-HungLiu等[5]研究了影响伯克氏菌属发酵生产脂肪酶的因素，发现当曝气量从0.5调节到2时，能使脂肪酶生产速率从0.057提高至0.076U/(ml•h)，由此可见溶氧量增加会促进脂肪酶的生产。RafaelResendeMaldonado等[6]考察了温度、初始pH、蛋白胨和豆油浓度对地霉菌产脂肪酶的影响，得到最优条件为温度30℃、初始pH7.0、3.0%蛋白胨、0.5%豆油，此时产量16U/mL。G.Kishan[7]对解脂假丝酵母生产脂肪酶培养基的关键成分进行了正交试验设计，试验表明麻花含量6.0%、葡萄糖2.0%、MnCl20.2%和KH2PO40.2%时，得脂肪酶的最大生产量9.40U/mL。ChristinaPapagora等[8]采用响应曲面法优化了德巴利酵母菌体外生产脂肪酶的培养基成分，发现酵母提取物5.0%、蛋白胨10%、K2HPO44.0%、MgSO4•H2O1.0%、葡萄糖13.1%、橄榄油19%、pH值6.4为最佳条件，此时脂肪酶活7.44U/mL，比之前高2.28倍。MarıaGuadalupeSanchez-Otero[9]利用响应曲面法显著改善了地芽孢杆菌CCR11生产脂肪酶的效率，得出营养肉汤的最优浓度3.8g/L和最佳温度39.5℃。再经验证实验，证实最优条件下脂肪酶的产量达到(2283.70±118.36)U/mL，比未优化前高6.7倍。

　　3其他提高酶产量的生物学方法

　　提高脂肪酶产量的方法，除优化生产过程的培养条件，还可采用其他手段，譬如诱变育种、异源表达、定点突变、定向进化等。

　　3.1诱变育种

　　高产、优质的产酶菌株逐渐成为其应用研究开发的关键。除寻找天然优质菌株，诱变育种也是一种有效手段。诱变育种是用物理或化学诱变剂处理菌株提高其突变率，再筛选出少数满足要求的突变株。诱变剂主要有亚硝酸、紫外线、亚硝基胍、快中子、硫酸二乙酯等，正突变筛选剂一般有溴化乙锭、胆盐、克霉唑、柠檬酸钠、琥珀酸钠、丁酸、三丁酸甘油酯和己酸等。此法一般可将脂肪酶产量提高10倍左右，最大可达40倍。杨帆等用紫外诱变了从深海环境中筛选一株产低温脂肪酶菌株，在诱变剂量81%时，得到一株能稳定遗传的正突变株UM3，此时酶活达2540～2710U/mg，比原始菌株提高34%～39%[10]。

　　3.2异源表达

　　异源表达是指将某来源的脂肪酶基因在另一生物体内或细胞内实现表达，常见于在微生物及病毒中的表达。郭勇亮将米根霉基因组作为模板，参照NCBI公布的米根霉脂肪酶基因序列进行引物设计，试验后得到编码米根霉脂肪酶前导肽序列及成熟序列的基因——ProROL，在此基础上，展开pPIC9K-ProROL质粒的构建，线性化后电转化感受态毕赤酵母菌株GS115，最后再经过严格筛选，成功得到阳性重组菌。摇瓶及7L罐发酵结果显示，以p-NPP为底物，摇瓶诱导3.5天后上清液酶活为10.6U/mL。实现了脂肪酶的高效异源表达[11]。王建荣等[12]利用同源克隆法获得了门多萨假单胞菌P10脂肪酶基因的全长序列，经检测表明，该基因的DNA全长序列为801bp，编码267个氨基酸，经推测，这是一种相对分子量为29.95kU的蛋白。然后再通过将该脂肪酶基因连接到pPICZαA载体上，构建重组表达质粒，最后转化到毕赤酵母X-33中。脂肪酶基因在毕赤酵母X-33中实现分泌表达，摇瓶发酵液上清酶活最大可达8U/mL。

　　3.3定点突变

　　定点突变指通过PCR等手段定向改变目的DNA片段，包括碱基的添加、删除、点突变等。较之化学突变和自然突变，定点突变具有突变率高、重复性好的等优点，已被广泛用于酶性能的改善。为获得耐热型PLD，JasminaDamnjanovic等[13]尝试了定点突变组合突变体的高通量筛选方法。采用在链霉菌属PLD特定的氨基酸位点引入随机突变的方法，筛选获得热稳定性最好的D40H/T291Y突变体，试验表明：较之野生型，该突变体的酶活在65℃条件下的半衰期更长。

　　3.4定向进化

　　酶的体外定向进化是人为地有计划地通过突变和体外重组酶的基因进而得到高性能脂肪酶的方法[12]。较之自然进化，定向进化法只作用于突变后的分子群，更有计划与目的性。然而保证基因突变库的丰富性与多样性是该方法成功的前提，再者还依赖于合适的筛选压力及高灵敏度高通量的筛选检测技术。刘浩[14]等对圆弧青霉碱性脂肪酶I(PCL)进行了定向进化，通过重叠PCR和易错PCR技术，最终得到两株热稳定性明显提高的变异体L41P和G47I。

　　4展望

　　21世纪是生命科学的世纪，脂肪酶的生产也要依靠于生物技术。要将更多先进的生物技术运用到脂肪酶的生产、应用研究中，不断改良菌株，提高酶活，提升酶特性，是今后的发展方向。

　　作者：徐锁玉单位：江苏旅游职业学院

文章名称：脂肪酶生产中生物技术的作用

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