苦参碱对子宫内膜癌细胞有何作用

来源：职称阁分类：医学论文时间：2018-06-15 16:38热度：

　　子宫内膜癌是一种常见的临床妇科恶性肿瘤。近年来流行病学调查显示，子宫内膜癌的发病率逐年上升。目前，它在女性整体恶性肿瘤中排名第四，接下来小编简单介绍一篇优秀医学职称论文。

苦参碱对子宫内膜癌细胞有何作用

　　苦参碱是中药苦参的干燥根提取物，研究显示，苦参碱具有着抗病毒、抗感染、增强机体免疫力、平喘、保肝、升高白细胞等药物作用;且近年来研究表明，苦参碱具有着明显的体内、外抗肿瘤作用，在胃癌、肝癌、肺癌以及白血病中具有着明显的抑制肿瘤增殖作用[2-4]。本研究探讨分析苦参碱对人子宫内膜癌细胞的增殖抑制作用及其可能的机制，现报道如下。

　　1材料与方法

　　1.1细胞来源

　　人子宫内膜癌细胞株Ishikawa，购于中国科学院上海细胞库。

　　1.2主要试剂及仪器

　　苦参碱注射液(纯度>99%，美国sigma公司);MTT(美国sigma公司);DMEM/F12培养基(美国Hyclone公司);0.25%胰蛋白酶(美国Gbico公司);澳洲胎牛血清(美国Gbico公司);RnaseA(美国sigma公司);青霉素链霉素(美国Hyclone公司);碘化吡啶(美国sigma公司);二甲基亚砜DMSO(美国sigma公司)兔单克隆核因子κB(NF-κB)p65抗体(美国ab-cam公司);兔单克隆血管内皮生长因子(VEGF)抗体(美国abcam公司);辣根过氧化物酶标记山羊抗体IgG(北金中杉金桥公司)。MicroReader550酶标仪(美国Bio-Rad公司);CO2细胞培养箱(德国Heraeus公司);Facscalibur流式细胞仪(美国BD公司);倒置显微镜(日本Olympus公司)。

　　1.3方法

　　1.3.1细胞培养使用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基对Ishikawa细胞进行常规培养，加入100U/ml青霉素以及100μg/ml链霉素，孵箱内环境37℃、5%CO2，在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，每2～3d进行一次消化传代。1.3.2苦参碱配置使用少量DMOS溶解1mg苦参碱，然后使用PBS对其进行母液稀释(1mg/ml)，经过过滤除菌以后，再放入4℃冰箱内进行冷藏，使用时用培养基进行稀释。1.3.3细胞增殖(MTT法)取对数生长期细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，用培养基将其制成浓度为104/ml的单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板内，每孔100μl，置于孵箱内培养24h。调整苦参碱浓度，分别为0、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml、320μg/ml，每个浓度设置5个复孔，继续培养24h以及48h后，每孔加入20μlMTT溶液(5g/L)，孵箱内继续孵育4h。吸出上清液以后，将200μl二甲基亚砜加入各个孔中，然后进行摇晃，直到停止反应为止，此外，还需要对490nm处各孔吸光度(A)进行检测，使用的仪器为酶标仪，将增殖抑制率算出。增殖抑制率=(A对照组-A药物组)/A对照组×100%。1.3.4细胞周期(流式细胞技术)生长期细胞的选取要呈对数，消化0.25%胰蛋白酶之后，细胞通过培养基制成单细胞悬液，呈1×105/ml浓度，在6孔板内接种，每孔接种1ml。常规培养24h，弃去上清，使用培养基调整苦参碱浓度，分别为0、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml，分别作为对照组、低浓度组、中浓度组和高浓度组，每组有3个复孔的设置，继续保持48h的培养。对各组细胞进行收集，使用4℃预冷70%乙醇完成12h固定。固定液在离心后去除，使用PBS清洗2次，然后加入PBS300μl，10mg/mlRnaseA溶液15μl，均匀混合，在37℃下行30min孵育。加入PI染液1mg/ml，放置在暗室中30min，300目筛网过滤后上机检测。

　　1.3.5VEGF、NF-κBp65蛋白表达(WesternBlot技术)生长期细胞的选取要呈对数，消化0.25%胰蛋白酶之后，细胞通过培养基制成单细胞悬液，呈1×105/ml浓度，在6孔板内接种，每孔接种1ml。常规培养24h，弃去上清，使用培养基调整苦参碱浓度，分别为0、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml，分别作为对照组、低浓度组、中浓度组和高浓度组，每组设置3个复孔，继续培养48h。各收集细胞，测定蛋白质浓度使用的方法为考马斯亮蓝蛋白质测定法。取样品蛋白→变性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)凝胶电泳→转膜→封闭→VEGF或NF-κBp65抗体(孵育16h，4℃)→洗膜3次→二抗(孵育1h，37℃)→洗膜3次。分析实验结果时使用化学发光显色法，相对定量分析蛋白条带灰度。相对含量=VEGF或NF-κBp65灰度值/β-actin灰度值，β-actin为内参条带。

　　1.4统计学处理

　　分析此次实验数据使用的软件为SPSS22.0，计量资料比较采用t检验，当P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2结果

　　2.1MTT法检测苦参碱对Ishikawa细胞增殖抑制作用

　　随着苦参碱药物浓度的增加，对Ishikawa细胞增殖抑制率明显升高，呈一定的剂量依赖性，苦参碱作用24hIC50为44.655μg/ml，苦参碱作用48hIC50为20.664μg/ml。见图1。

　　2.2各组Ishikawa细胞周期的比较

　　与对照组比较，Ishikawa细胞接受不同浓度苦参碱处理48h后，G1期细胞百分比升高，G2期以及S期细胞百分比降低(t=4.540～37.867，P<0.05);不同剂量组间G1期细胞百分比比较，高剂量组最高、中剂量组次之、低剂量组最低，G2期和S期细胞百分比比较，高剂量组最低、中剂量组次之、低剂量组最高。见表1、图2。

　　2.3各组Ishikawa细胞VEGF、NF-κBp65蛋白的比较

　　不同浓度苦参碱均可有效抑制Ishikawa细胞VEGF、NF-κBp65蛋白表达(t=3.096～8.078，P<0.001);且不同剂量组间比较，高剂量组最低、中剂量组次之、低剂量组最高。

　　3讨论

　　子宫颈癌作为一种常见的妇科恶性肿瘤，化疗是目前治疗的重要手段之一，但是由于常规化疗药物的毒副作用，限制了其应用，而中药由于其毒性小等优点，成为了目前抗肿瘤研究的热点[5]。苦参碱是中药苦参中含量最高的生物碱成分之一。学者研究结果显示，苦参碱具有着显著的体内外抗肿瘤作用，可有效抑制人胃腺癌MKN45和SGC7901细胞系、人肝癌SMMC-7721细胞系、白血病K562细胞系的细胞增殖。此外，对于多药耐药细胞株K562/dox和K562/vin，苦参碱同样具有着明显的诱导凋亡作用[6-8]。本研究探讨分析苦参碱对人子宫内膜癌细胞增殖抑制的作用机制。可将子宫内膜癌分为雌激素依赖型以及非雌激素依赖型，其中雌激素依赖型子宫内膜癌的发生与内源性或外源性雌激素的异常增高有关，是子宫内膜癌的主要类型[9]。Ishikawa细胞株为雌激素受体阳性人子宫内膜癌细胞，属于雌激素依赖型子宫内膜癌。本研究结果显示，随着苦参碱药物浓度的增加，对Ishikawa细胞增殖抑制率明显升高，呈一定的剂量依赖性，苦参碱作用24hIC50为44.655μg/ml，苦参碱作用48hIC50为20.664μg/ml。与相关研究报道结果相似[10]，苦参碱对人子宫内膜癌细胞株具有着明显的增殖抑制作用，且其作用与药物剂量、作用时间有关。对于苦参碱对妇科肿瘤的作用机制，目前尚无统一结论。研究显示，苦参碱对妇科恶性肿瘤的价值之一为通过细胞周期调控来抑制肿瘤细胞的增殖[11，12]。正常细胞通过对细胞周期G1-S相以及G2-M相两个节点的控制来调控细胞周期进程，而肿瘤细胞由于一直处于无限恶性增殖状态而不能进入静止期[13]。本研究结果显示，不同浓度苦参碱处理Ishikawa细胞48h后，G1期细胞百分比升高，G2期以及S期细胞百分比降低(P<0.05)，且随着苦参碱药物浓度的增加，变化越显著(P<0.05)。表明苦参碱可将Ishikawa细胞阻滞于G1期，从而抑制细胞的增殖，且其细胞周期调控作用呈剂量依赖性，这与学者相关研究报道结果相似[13]。在肿瘤的发生发展过程中VEGF的作用非常重要，是一种特异性高且作用强的诱导肿瘤血管生成相关调控因子[14，15]。VEGF对血管内皮细胞的增殖、黏附、迁移具有着直接的促进作用，从而促进肿瘤新生血管的形成[16]。学者研究发现，NF-κB可通过自分泌/旁分泌的形式建立反馈机制，从而促进肿瘤的浸润和转移[17，18]。且研究显示，NF-κBp65蛋白可能促进了子宫内膜样腺癌的形成和进展[19，20]。本研究结果显示，不同浓度苦参碱可有效抑制Ishikawa细胞VEGF、NF-κBp65蛋白表达(P<0.05)，且随着浓度的增高，Ishikawa细胞VEGF、NF-κBp65蛋白表达越低(P<0.05)。表明苦参碱对Ishikawa细胞抑制作用可能与抑制VEGF、NF-κBp65蛋白表达有关，从而抑制肿瘤新生血管生成以及肿瘤的浸润和转移。

　　4结论

　　综上所述，人子宫内膜癌细胞通过苦参碱能够得到明显的抑制，而且具有一定程度上的剂量依赖性，其可能具有将肿瘤细胞阻滞于G1期的作用机制，抑制VEGF、NF-κBp65蛋白表达。但是本研究仍存在明显不足:受实验室设施、设备条件及研究经费等限制，并未对基因水平上的作用机制和信号通路进行深入探讨，应当将该药物究竟如何对VEGF、NF-κBp65蛋白的分泌发挥抑制作用的作为进一步研究的重点，以便为其在临床实践中的应用研究奠定理论基础。

文章名称：苦参碱对子宫内膜癌细胞有何作用

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