前列腺癌细胞中三白草酮的作用

来源：职称阁分类：医学论文时间：2018-10-10 11:12热度：

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前列腺癌细胞中三白草酮的作用

　　关键词：三白草酮;前列腺癌;增殖;MARK通路

　　前言

　　前列腺癌是当前全世界男性泌尿系统发病率最高的肿瘤，药物治疗是前列腺癌的主要治疗手段。但越来越多的证据表明，前列腺癌细胞对常规药物的耐药性是一个重要的问题，亟待寻找更有效的新型药物[1]。中草药是癌症潜在治疗药物的重要来源[2]。三白草[Saururuschinensis(Lour.)Baill，SC]是最早记载于《本草经集注》的三白草科植物，并被《中国药典(2010年版)》收录，主要分布于我国河南、河北以及长江流域地区，作为一种传统中药，具有良好的清热解毒、利尿消肿作用。现代医学通过对三白草的活性成分进行有效提取，发现其有效成分为三白草酮，可用于治疗炎症性疾病、黄疸、淋病、水肿等[3-5]。有研究发现三白草酮还具有抗癌作用，但具体机制有待进一步研究[6，7]。本研究将三白草酮作用于前列腺癌细胞PC3，探究其对细胞增殖和凋亡的作用及其机制，为前列腺癌的临床治疗提供新的思路。

　　1材料与方法

　　1.1材料三白草(产地：河北保定，货号ml042275)购自上海酶联生物科技有限公司，经陕西省食品药品检验所标本室鉴定为三白草;人前列腺癌细胞系PC3细胞为本实验室培养;RPMI1640培养基和胎牛血清(FBS)购自Gibco-BRL;一抗ERK、p-ERK、CyclinD1购自CellSignal公司;HRP-缀合的抗小鼠IgG或抗兔IgGAb购自SantaCruz;MTT购自Amresco公司;流式细胞仪购自Biosciences。1.2三白草酮的提取与测定将三白草地上部分粉碎至粉末，粉碎度为10目筛，精密称取150g置入1L萃取釜中，95%CO2作为夹带剂，用量为1倍，进行萃取，萃取条件为：30MPa，50℃，2h。将萃取物置于锥形瓶中，加入25mL甲醇，静置30min后回流提取1h，过滤至50mL量瓶中，对残渣按以上步骤重复处理，甲醇定容至50mL，0.45μm微孔滤膜过滤，得到三白草酮。HPLC测定三白草酮含量，色谱条件为：AgilentKinetexC18色谱柱(10x4.6mm3μm2.6(8，)，用5%~100%乙腈水溶液洗脱，流速0.5mL•min-1，柱温40℃，样品注入体积为3μL，检测波长为280nm(图1)。图1三白草酮色谱图Fig.1HPLCchromatogramsofsauchinone1.3细胞培养将PC3细胞加入含100U•mL-1青霉素、100U•mL-1链霉素和10%热灭活胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于37℃、5%CO2条件下培养，至细胞汇合度70%~90%时，用0.05%胰蛋白酶消化细胞，EDTA传代培养。1.4MTT检测PC3细胞的增殖取对数生长期的PC3细胞，调整细胞密度至4×104mL-1，接种于96孔板中。待细胞贴壁后，分别加入浓度为10。50。100。200μg•mL-1的三白草酮培养液200μL。空白对照组加入200μL培养液，培养24h后，加入20μL5mg•mL-1的MTT溶液，避光培养4h后，用200μLDMSO溶解，570nm处测定光吸收值，计算细胞增殖抑制率。1.5流式细胞仪检测PC3细胞周期将PC3细胞以4×104/孔加入细胞用200铺板，加入200μg•mL-1三白草酮处理48h。收集细胞，冷冻PBS洗涤2次，将细胞沉淀物重悬于冷冻PBS中，预冷的100%乙醇固定，置于-20℃冰箱保存过夜，13000rpm离心并再次重悬，加入1mg•mL-1RNA酶，37℃孵育1h后，室温下加入碘化丙啶染色30min，流式细胞仪检测细胞周期，CellQuest3.0f软件进行分析。1.6Westernblot检测PC3细胞中ERK、p-ERK、cyclinD1蛋白的表达离心收集不同浓度三白草酮处理48h的PC3细胞，PBS洗涤，重悬于含蛋白酶抑制剂[50mMTris-HCl(pH7.5)，150mMNaCl]的溶液中，提取总蛋白并测定含量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1h，PBS洗涤。分别加入ERK、p-ERK、cyclinD1及βactin一抗进行温育，摇摆过夜，然后加入抗小鼠IgG或抗兔IgGAb孵育1h，化学发光底物ECL显色。1.7细胞划痕实验检测PC3细胞的迁移能力将PC3细胞接种于12孔板，未完全融合时饥饿培养12h后，用10μL白色枪头垂直轻柔划痕，并清洗因划痕产生的细胞碎片，作为加药前的对照组;然后用200μg•mL-1三白草酮分别处理24h、48h，相差显微镜下观察并拍照。1.8统计学方法应用SPSS14.0软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，方差分析(ANOVA)采用Bonferroni检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1三白草酮对PC3细胞增殖的影响随着三白草酮浓度的增加，PC3细胞的存活率逐渐降低，且作用48h后呈明显的浓度和时间依赖性(图2)。计算IC50值为200μg•mL-1，作为后续实验的药物作用浓度。2.2三白草酮对PC3细胞周期的影响与对照组相比，200µg•mL-1三白草酮处理的PC3细胞G1期比例明显增加(P<0.05)，表明细胞发生了G1期阻滞(图3)。2.3三白草酮对PC3细胞中ERK、p-ERK、cyclinD1蛋白表达的影响经10、50、100、200µg•mL-1的三白草酮处理48h后，PC3细胞中p-ERK和cyclinD1的表达水平显著降低(P<0.05)，EPK表达水平无明显变化(P>0.05)(图4)。2.4三白草酮对PC3细胞迁移的影响与对照组相比，200µg•mL-1三白草酮处理24h和48h后，细胞划痕间距明显较宽(图5)，划痕修复率均显著低于对照组(P<0.05)(表1)。

　　3讨论

　　三白草作为传统中药在我国的使用历史悠久，具有良好的清热解毒、利尿消肿及消炎作用，且毒性低、副作用小。现代医学研究发现，三白草的有效成分三白草酮对肿瘤细胞也有良好的抑制作用，越来越受到研究者的关注[8]。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是目前已知的在肿瘤增殖、分化、侵袭、迁移过程中发挥重要作用的信号通路之一[9]，而ERK是其亚家族成员，磷酸化ERK(p-ERK)是ERK的活化形式。MAPK通路可将信号传导至细胞核，并激活下游的cyclinD1蛋白[10]，对肿瘤细胞的增殖和分化具有重要作用。细胞周期中，G1期启动是细胞活动的关键。Seo等[11]发现，cyclinD1蛋白的表达与G1期长短有着密切关系，cyclinD1表达水平越高，G1期越短;且cyclinD1过表达可有效降低肿瘤细胞对细胞外刺激信号的依赖性。Chintana等[12]将姜黄素和四氢姜黄素作用于裸鼠HepG2细胞，发现p-ERK1/2表达被抑制，肿瘤细胞面积也明显减少。Jeong等[13]研究发现，三白草酮增加了AnnexinV阳性凋亡小体和胃癌AGS细胞中磷酸化JNK和p38的数量，下调抗凋亡基因Bcl-2并上调凋亡基因Bax的表达。Kim等[14]发现三白草酮可以剂量依赖方式抑制人HCC细胞的增殖，诱导细胞周期G0/G1期停滞和线粒体功能障碍，并通过激活JNK/p38信号通路促进细胞凋亡。本研究发现，三白草酮对前列腺癌PC3细胞表现出显著的细胞毒性。三白草酮作用于PC3细胞48h后，随着药物作用浓度的升高，细胞存活率显著降低，G1期细胞比例显著升高，p-EPK和cyclinD1蛋白表达显著下调，细胞划痕实验显示三白草酮可显著抑制PC3细胞的迁移。综上所述，三白草酮可抑制前列腺癌PC3细胞增殖，其机制可能是抑制MARK信号通路的活性。

　　作者：吴冰崔颖甄威李鹏艳魏洪波单位：辽宁省中医药研究院/辽宁省中医药大学附属第二医院

文章名称：前列腺癌细胞中三白草酮的作用

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